El juego comienza revelando al personaje principal Aya Brea, la protagonista del juego original de Parasite Eve, que ahora tres años después del incidente de Nueva York, es una agente del FBI en su investigación y represión del equipo mitocondrial (MIST) que se envía en una misión urgente en el centro de Los Ángeles, donde ha habido informes de NMC. El primer capítulo en el juego pone a Aya en la posición de la investigación de la torre Acrópolis, donde encuentra un equipo completo de SWAT sacrificados y una infestación de NMC. Ella pronto descubre que el NMC puede tomar forma humana y, finalmente, se encuentra con un tipo diferente de criatura, un humanoide Artificial Neomitochondrial Creature (ANMC en siglas, ‘criatura artificial neomitocondrial’) del tipo gólem conocido como N.º 9. Ella se encuentra con este NMC tres veces. El gólem N.º 9 destruye la torre Acrópolis, pero Aya junto con su compañero Rupert Broderick, que ha estado en el lugar antes de que ella llegue, logran escapar en un helicóptero de la policía.

Después de un breve interludio, Aya se dirige a una ciudad del desierto de Dryfield. No es nada más que una parada de camiones, en una carretera que rara vez se utiliza, con un motel, tienda, bar y taller de mecánica. Al llegar, descubre que Dryfield también está infestado de NMC. Más tarde se encuentra con un sobreviviente (el señor Douglas) y su perro, Flint, que actuará como su fuente de noticias y equipo durante gran parte del juego. Más tarde se rescata a Kyle Madigan, un investigador privado que afirma que está en una misión similar a la de Aya. Él le dice acerca del Refugio, una instalación cercana de metro que pueden tener las respuestas a los recientes brotes de NMC.

Después de pasar algún tiempo en Dryfield, Aya y Kyle encuentran una entrada a una vivienda ubicada en una mina abandonada. Al entrar en aquella mina, Kyle desparece repentinamente llegando a hacer pensar a Aya que está muerto, por lo que investiga la vivienda sola. Como Aya explora el refugio descubre que los NMC son el resultado de la ingeniería genética en un intento de crear artificialmente superiores formas de vida, y que de alguna manera que ella está muy involucrada. La historia del juego se desarrolla a través de varias escenas de animación que aparecen a intervalos regulares en puntos de la trama se ha disparado, una de ellas revela que la ANMC fueron creados a partir de su propio ADN.

Finalmente, Aya descubre la última área del juego, los Neo Ark (Shambala en la versión japonesa), que es la entrada a la que se oculta en el refugio. Ella se entera de que la instalación de Ark estaba destinado a ser un escaparate de la tecnología NMC, dividido en diferentes hábitats, con comentarios como visitante del zoológico y plataformas de observación en toda la zona. La contención de los Hábitat se ha roto y los NMC están sueltos. Esta zona está infestada de las criaturas también. El objetivo en esta área es de Aya para desactivar el generador de energía, que permite el acceso a un área que no pudo ser localizado en el refugio. Volviendo a la vivienda, se reúne con Kyle, Aya rescata a una chica que ha sido manipulada en el control de la hostil NMC. También descubre que la chica cuyo nombre curiosamente es Eve, fue creada a partir de su propio ADN, por lo que ella, en cierto sentido, es la hija de Aya. Eve es secuestrada por N.º 9.

Volviendo a la entrada del refugio, Aya se encuentra con un pequeño ejército de golems, pero es rescatada por los Marines de EE. UU., que han sido alertados por Aya por sus contactos en MIST. Más tarde, recibe un regalo del señor Douglas, a través de Flint, de los suministros. Ella decide usar a Flint a ayudarla a encontrar a Eve, lo que le llevan de Eve que le permitiera seguir su rastro. Él la lleva de vuelta al refugio. Aya sigue las pistas de Eve hasta una sala que contiene un capullo enorme, para buscar la a Eve y N.º 9. Kyle está allí también, al parecer, N.º 9 ayuda. Kyle se convierte finalmente en el N.º 9, que le impide colocar la víspera en el capullo. Después de una escena que muestra un arma vía satélite de ser despedido por órdenes del Presidente, y Dryfield ser borrado del mapa, Aya y Kyle se encuentran separados por un agujero que ha penetrado en todas las plantas del refugio. Ella mira hacia abajo para ver la víspera colgando sobre un pedazo de escombros en el borde de uno de los niveles inferiores.

Finalmente, los saltos de capullo abierto de haber sido desplazado por el impacto del arma, que revela al mayor NMC de todos. Después de derrotar a esta criatura, la víspera se transforma en un NMC con alas muy rápido y poderoso que se parece a Melissa Pearce-víspera de la segunda a la última forma del primer juego. Una vez más Aya debe luchar. Una vez que esta batalla final se llegó a la conclusión, varias escenas de corte se muestran en función de las acciones del jugador durante el juego.

Jugabilidad

Uno de los aspectos que más se destacan del juego, es el repentino cambio que hizo Squaresoft en la jugabilidad al darse cuenta de que Parasite Eve estaba diseñado más bien como un shooter en tercera persona que como un RPG. En esta entrega toma un aspecto más al estilo de Resident Evil, pudiendo correr con un arma en la mano y entrando en batalla con monstruos que ya están en una habitación, y no que aparecen de la nada, al estar cerca de ellos, al inicio de la batalla.

También es muy notable la variedad de armas, municiones y enemigos presentes que no se incluían en la anterior entrega, llegando a tener tres municiones distintas para armas; pistolas, escopetas, ametralladoras, rifles de asalto y lanzagranadas. Los enemigos aparecen en varios colores siendo capaces de atacar e incluso tragarse al personaje, usar ataques psíquicos o ataques físicos como golpes o mordiscos, una estructura mucho más dinámica que Parasite Eve.

Aya Brea también dispone de poderes (como en la anterior entrega), los cuales deberán recobrarse ganando puntos de experiencia (EXP). En total son doce poderes: tres de fuego (Pyrokinesis, Combustion y Inferno), tres de agua (Healing, Metabolism y Life Drain) tres de tierra (Antibody, Energy Shot y Energy Ball) y tres de viento (Plasma, Necrosis y Apobiosis); una vez que se ha alcanzado el nivel máximo (que es el nivel tres)de los dos poderes de un elemento aparecerá el tercero y último del mismo elemento (mencionados anteriormente), siendo estos más poderosos que los primeros dos. Una característica nueva es la ganancia de "BP" (Bounty Points) los cuales se usan para la compra de objetos, armaduras, balas y armas. El contador de "HP" y "MP" (Health Points y Mithocondrial Power respectivamente)se aprecia en la pantalla superior, y se va recuperando al usar un tipo especial de armaduras o usando objetos.

Otro detalle es su modo de replay, que ofrece armas y objetos nuevos adjuntos a la partida; la cual ofrece 4 niveles: Modo Normal: Se inicia normalmente con objetos y características especiales. Modo Bounty: Se obtienen recompensas al matar a los gólems, hay un poco de dificultad. Modo Scavenger: Modo mísero y difícil, completándolo se logra desbloquear otro modo. Modo Nightmare: Modo pesadilla, mucho más complejo y difícil.

En el juego se aprecian etapas, apareciendo en un centro comercial de Los Ángeles, luego en un pueblo en el desierto de Mojave, para llegar al último sitio llamado Refugio.

De modo similar a otros juegos de Squaresoft, los personajes no tienen voces, salvo en momentos muy puntuales y solo gritos, alaridos y saludos.